La rehidratación con láser restaura la estructura proteica tras la deposición al vacío para CryoEM

La microscopía electrónica criogénica (cryoEM) ha transformado la biología estructural, pero su preparación convencional de muestras —mediante secado por absorción y congelación por inmersión— presenta limitaciones persistentes. Las proteínas permanecen durante segundos en la interfaz aire-agua antes de la vitrificación, período durante el cual se estima que el 90 % se adsorbe a dicha interfaz, frecuentemente desnaturalizándose o adoptando orientaciones preferentes que comprometen la calidad de la reconstrucción tridimensional. El aterrizaje suave sobre rejillas de cryoEM mediante espectrometría de masas nativa (MS) ha surgido como una alternativa prometedora, ya que evita por completo la interfaz aire-agua y permite además la purificación en fase gaseosa de mezclas complejas. Sin embargo, persistía un obstáculo crítico: las proteínas depositadas en vacío pierden agua, lo que provoca una compactación estructural medible que degrada la resolución y distorsiona la conformación nativa.

El equipo de Wisconsin amplió su instrumento de cryo-landing descrito previamente incorporando dos nuevos componentes: un dosificador molecular de agua que deposita hielo amorfo a una tasa calibrada de 1,2 nm/s, y un láser de onda continua a 532 nm modulado en pulsos de 15 μs mediante un modulador acusto-óptico. Tras el cryo-landing de iones de β-galactosidasa sobre rejillas UltrAuFoil recubiertas de carbono a una corriente iónica de ~12 pA durante 25 minutos, se depositó hielo amorfo sobre las partículas. El haz láser enfocado (~20 μm FWHM, 15–26 mW en la rejilla) se desplazó sistemáticamente por la superficie de la rejilla, licuando brevemente el hielo y permitiendo que las moléculas de agua rehidrataran las proteínas compactadas antes de que la masa térmica de la rejilla revitrificara rápidamente la muestra. La transferencia completa posterior al láser hacia nitrógeno líquido fue controlada por ordenador y se completó en menos de un segundo.

Las imágenes de cryoEM obtenidas en un microscopio Glacios de 200 kV revelaron diferencias notables entre las condiciones analizadas. Utilizando la correlación de la capa de Fourier (FSC) mapa-modelo frente a la estructura PDB 6CVM con un umbral de 0,5, las partículas rehydratadas con láser tras el cryo-landing alcanzaron una resolución de 8,2 Å, frente a solo 20 Å para las partículas sin láser de la misma rejilla —una mejora de 2,4 veces—. Las partículas congeladas convencionalmente por inmersión alcanzaron 5,9 Å en condiciones de imagen más favorables (ampliación de 120.000× frente a 73.000×, tamaño de píxel menor). Para garantizar una comparación equitativa, las tres reconstrucciones se calcularon con el mismo número de partículas: 5.684. Las partículas rehidratadas con láser no mostraron compactación detectable y coincidieron con la estructura cuaternaria nativa conocida del homotetrámero de β-galactosidasa.

Las partículas del cryo-landing sin láser, en cambio, exhibieron la compactación previamente documentada por Rauschenbach et al. mediante simulaciones de dinámica molecular —un colapso de la capa de hidratación de la proteína y de sus contactos terciarios bajo vacío—. El paso de rehidratación con láser revierte eficazmente este daño al restablecer de forma transitoria un entorno acuoso alrededor de cada partícula antes de fijarla nuevamente en hielo vitreo. Los promedios de clases 2D y los mapas de distribución angular de la muestra rehidratada se asemejaron estrechamente a los de las partículas congeladas por inmersión, lo que indica una homogeneidad conformacional restaurada y una orientación más isotrópica de las partículas.

Las implicaciones van mucho más allá de la β-galactosidasa como sistema modelo. Dado que la MS nativa puede separar y seleccionar especies moleculares específicas de mezclas heterogéneas —incluidos lisados celulares—, esta plataforma acoplada MS-cryoEM podría permitir la determinación estructural de proteínas que no pueden purificarse por métodos bioquímicos convencionales. Los autores reconocen que la resolución actual (8,2 Å) aún no alcanza la de la congelación por inmersión (5,9 Å), lo que probablemente se debe a la menor ampliación empleada para las rejillas del cryo-landing y al conjunto más reducido de partículas, y no a ninguna limitación fundamental del enfoque de rehidratación. Se espera que la optimización futura del grosor del hielo, los parámetros del láser y las condiciones de imagen permita cerrar esta brecha.