Gli scienziati scoprono come la tossina del C. difficile si impossessa dei macrofagi per alimentare l'infiammazione intestinale

L'infezione da <i>Clostridioides difficile</i> è una delle principali cause di colite associata agli antibiotici e può evolvere verso complicanze potenzialmente letali. La sua tossina principale, TcdB (~270 kDa), è considerata il principale driver della malattia, in parte attraverso l'attivazione dei macrofagi con conseguente rilascio di citochine infiammatorie che aggravano il danno alla barriera intestinale. Nonostante ciò, il recettore di superficie dei macrofagi che media gli effetti infiammatori di TcdB — e il meccanismo molecolare a valle — erano rimasti sconosciuti.

Questo studio si è concentrato sul dominio di legame alla frizzled (FBD) di TcdB, un sottodominio all'interno della regione di consegna e legame al recettore. I ricercatori hanno dimostrato che FBD da solo è in grado di indurre l'infiammazione dei macrofagi (secrezione di IL-1β e IL-6) a livelli comparabili a quelli della TcdB a lunghezza intera, ma, elemento cruciale, FBD era privo di citotossicità anche ad alte concentrazioni (1000 pM), rendendolo uno strumento ideale per studiare il legame al recettore infiammatorio senza effetti confondenti legati alla morte cellulare.

Utilizzando FBD come proteina esca in saggi di pull-down/spettrometria di massa su macrofagi THP-1 differenziati con PMA, CD44 è stato identificato come il principale partner di legame sulla superficie dei macrofagi per TcdB/FBD. Questo risultato è stato validato mediante knockout di CD44 mediato da CRISPR/Cas9 nei macrofagi e in topi knockout per CD44, entrambi i quali hanno mostrato risposte infiammatorie marcatamente ridotte a TcdB/FBD. La co-immunoprecipitazione e la risonanza plasmonica di superficie hanno confermato l'interazione fisica diretta tra FBD e CD44.

Per svelare il meccanismo molecolare a valle, il gruppo di ricerca ha impiegato la proteomica quantitativa delle modificazioni per succinilazione label-free 4-D — un approccio all'avanguardia per rilevare le variazioni di succinilazione della lisina nell'intero proteoma. È stato riscontrato che il legame di TcdB/FBD a CD44 sopprime SUCLG2 (subunità della succinil-CoA ligasi), aumentando la disponibilità di succinil-CoA e promuovendo la succinilazione di CD44 in corrispondenza del residuo di lisina 158 (K158). Questa modificazione ha potenziato la traslocazione nucleare di NF-κB e l'attività trascrizionale, amplificando la produzione di citochine infiammatorie. La mutazione di K158 in arginina (che blocca la succinilazione) o in glutammato (che mima una succinilazione costitutiva) ha confermato l'importanza funzionale di questo specifico sito.

Infine, i ricercatori hanno dimostrato che il blocco competitivo dell'interazione TcdB–CD44 — mediante anticorpi neutralizzanti anti-CD44 o dominio extracellulare ricombinante di CD44 come esca — ha attenuato significativamente l'infiammazione dei macrofagi in vitro e ridotto la gravità della malattia in un modello murino di infezione da <i>C. difficile</i>. Questi risultati stabiliscono l'asse TcdB/FBD–CD44–succinilazione K158–NF-κB come un percorso terapeuticamente perseguibile per la prevenzione e il trattamento della malattia associata a <i>C. difficile</i>.