La vitamina B2 elimina le infezioni fungine da Cryptococcus distruggendo le membrane e aumentando lo stress ossidativo

Cryptococcus neoformans causa una stima di 152.000 casi di meningite ogni anno nel mondo, con circa 112.000 decessi; la meningite criptococcica associata all'HIV presenta un tasso di mortalità vicino al 70% nei contesti a basso reddito dell'Africa subsahariana. Il trattamento attuale si basa sull'amfotericina B liposomiale più flucitosina, seguita da fluconazolo, ma fino al 60% dei pazienti va incontro a recidiva a causa della resistenza al fluconazolo, e i costi dei farmaci rimangono proibitivi nelle aree ad alta incidenza. Questo studio ha indagato la riboflavina (RF), un'essenziale vitamina B idrosolubile già ampiamente approvata e a basso costo, come candidato antimicotico da riposizionamento farmacologico nei confronti del ceppo di riferimento C. neoformans H99.

Mediante microdiluizione in brodo secondo gli standard CLSI M27-A4, i ricercatori hanno determinato che la MIC90 della riboflavina nei confronti di H99 è pari a 0,4 mg/mL. La concentrazione fungicida minima (MFC) era di 0,8 mg/mL, con un rapporto MFC/MIC di 2, che classifica la riboflavina come fungicida piuttosto che semplicemente fungistatica. Le prove con curva di crescita e diluizione in spot hanno confermato una soppressione dose-dipendente a concentrazioni comprese tra 0,1 e 0,8 mg/mL, con effetti paragonabili al controllo positivo fluconazolo a 32 µg/mL. I saggi di inibizione del biofilm con riduzione dell'XTT hanno mostrato riduzioni significative e dose-dipendenti dell'attività metabolica sia nei biofilm di nuova formazione sia in quelli preesistenti, con amfotericina B (0,5 µg/mL) utilizzata come comparatore positivo.

Gli studi meccanicistici hanno dimostrato effetti multi-bersaglio. La microscopia elettronica a trasmissione ha evidenziato blebbing di membrana, vacuolizzazione citoplasmatica e ispessimento della parete cellulare nelle cellule trattate con RF. La colorazione fluorescente con FITC-WGA e ioduro di propidio ha confermato il compromesso della parete cellulare e la permeabilizzazione della membrana. La citometria a flusso con DCFH-DA ha mostrato un'eccessiva accumulo intracellulare di ROS, e l'assorbimento di eosina Y ha ulteriormente supportato la presenza di disruzione di membrana. L'analisi RT-qPCR ha rivelato che la RF sovra-regola i geni di biosintesi della parete cellulare CHS3, CDA1 e FKS1, nonché i geni delle vie di risposta allo stress Pkc1 e Mpk1, in modo coerente con un tentativo cellulare di riparare il danno in corso alla parete. I geni dei fattori di virulenza CAP59 e Lac1/Lac2 (vie della capsula e della melanina) risultavano sovra-regolati in condizioni di stress da RF; tuttavia, i saggi funzionali hanno mostrato uno spessore della capsula e una produzione di melanina significativamente ridotti, suggerendo che la risposta trascrizionale fosse insufficiente a contrastare l'effetto inibitorio della riboflavina. Il gene dell'ureasi Ure1 risultava trascrizionalmente sotto-regolato, in correlazione con una ridotta attività ureasica nei saggi con brodo al rosso fenolo.

L'efficacia in vivo è stata valutata in due modelli murini: infezione intranasale che simula la criptococcosi polmonare, e infezione endovenosa che simula la meningite disseminata. Il trattamento con riboflavina ha ridotto significativamente il numero di unità formanti colonie (CFU) in polmoni, cervello, milza e reni rispetto ai controlli infetti non trattati. L'analisi istopatologica delle sezioni di polmone e cervello ha mostrato una marcata riduzione degli infiltrati infiammatori, del carico granulomatoso e della distruzione tissutale negli animali trattati con RF. Il profilo delle citochine plasmatiche nei punti temporali precoci dell'infezione ha rivelato riduzioni significative dei livelli di IFN-γ, TNF-α e IL-4 nei topi trattati con riboflavina, suggerendo una contestuale attenuazione della dannosa risposta iperinfiammatoria.

Questo studio fornisce la prima evidenza completa che la riboflavina esercita un'attività fungicida nei confronti di C. neoformans attraverso la disruzione di membrana, lo stress ossidativo mediato da ROS e la soppressione della virulenza, con un'efficacia in vivo trasferibile alla pratica clinica. In quanto micronutriente già approvato, a basso costo e ben tollerato, la riboflavina rappresenta un candidato interessante per il riposizionamento farmacologico in contesti con risorse limitate. Tuttavia, il lavoro è di natura preclinica e saranno necessari studi farmacocinetico/farmacodinamici, l'ottimizzazione della dose e studi di terapia combinata prima che possa essere presa in considerazione un'applicazione clinica.