CRISPR Prime Editing modelliert und korrigiert seltene GDF11-Mutation, die mit einer Wachstumsstörung in Verbindung gebracht wird

Seltene und extrem seltene genetische Erkrankungen betreffen weltweit Millionen von Menschen, doch der Weg von der genetischen Diagnose zur wirksamen Therapie bleibt enorm herausfordernd. Das Undiagnosed Diseases Network (UDN) hat durch Whole-Genome- und Whole-Exome-Sequenzierung über 886 Diagnosen gestellt, doch die Therapieentwicklung für diese hochindividualisierten Erkrankungen hinkt weit hinterher. Diese Studie schließt diese Lücke, indem sie einen vollständigen Arbeitsablauf – von der Krankheitsmodellierung bis zur Mutationskorrektur – mittels CRISPR Prime Editing für die de-novo-pathogene Variante eines einzelnen Patienten in GDF11 demonstriert, einem Gen, das ein Mitglied der TGF-beta-Familie kodiert, das Rollen in der Entwicklung, der Gewebehomöostase und dem Alterungsprozess spielt.

Die untersuchte spezifische Variante ist eine C-zu-G-Transversion an der Nukleotidposition 6.529 von GDF11 (NM_005811.4), die ein vorzeitiges Stoppcodon an Tyrosin 336 (Tyr336*) erzeugt. Diese Mutation wurde bei UDN-Teilnehmer 056 identifiziert, der mit Wachstumsverzögerung und Multisystem-Anomalien vorstellig wurde. Mithilfe von Prime Editing führte das Team diese exakt heterozygote Mutation in HEK293T-Zellen ein und generierte klonale Zelllinien, die den Genotyp des Patienten originalgetreu abbilden. Die Western-Blot-Analyse bestätigte, dass heterozygote (HET) Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen deutlich reduzierte GDF11-Proteinspiegel aufwiesen, was mit einem posttranslationalen Abbau übereinstimmt, der wahrscheinlich durch mit dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat assoziierte Qualitätskontrollwege vermittelt wird, und nicht allein durch den nonsensevermittelten mRNA-Abbau.

Die immunhistochemische Analyse der Golgi-Morphologie mittels des GOLPH2-Markers zeigte auffällige strukturelle Anomalien in HET-Zellen. Im Vergleich zu Wildtyp-Zellen wiesen HET-Klone eine signifikant erhöhte Anzahl kompakter, unregelmäßig geformter Golgi-Strukturen pro Zelle auf, was mit einer Golgi-Fragmentierung und -Stressreaktion übereinstimmt. Dieser Befund ist bemerkenswert, da GDF11 ein sezerniertes Protein ist, das den Golgi-Apparat passiert, und eine Beeinträchtigung seiner Prozessierung die Golgi-Homöostase direkt stören kann. Der Golgi-Phänotyp liefert einen zellulären Mechanismus, der die Mutation mit den entwicklungsbedingten und multisystemischen klinischen Merkmalen des Patienten verknüpft.

Das transkriptomische Profiling mittels RNA-seq (hinterlegt bei GEO: GSE312163) von Wildtyp- im Vergleich zu HET-HEK293T-Zellen zeigte eine weitreichende Dysregulation von Gennetzwerken. Herunterregulierte Signalwege umfassten metabolische und Golgi-assoziierte Biosynthesegene, während hochregulierte Signalwege Zell-Adhäsions- und extrazelluläre Matrixgene einschlossen. Diese transkriptionellen Verschiebungen wurden dahingehend interpretiert, dass sie die entwicklungsbedingten, neuralen und kardiovaskulären Phänotypen des Teilnehmers widerspiegeln und einen Haploinsuffizienz-Mechanismus für das Tyr336*-Allel unterstützen, anstatt eines dominant-negativen Effekts. Die Gen-Ontologie-Anreicherungsanalyse mittels ShinyGO und mit VolcaNoseR erstellte Vulkandiagramme lieferten statistische Unterstützung für diese Veränderungen auf Signalweg-Ebene.

Zur Mutationskorrektur testete das Team systematisch mehrere Prime-Editing-Strategien, wobei die Prime-Editor-Version (PE6 PEmaxΔRNaseH vs. PE7), das pegRNA-Gerüstdesign (Standard, tevopreq1, tmpknot) und Guide-RNA-Design-Tools (darunter Pridict KI-basiertes Design) variiert wurden. PE7 in Kombination mit einer Pridict-entworfenen pegRNA erwies sich als der effektivste Ribonukleoprotein-Komplex. Die Editierungseffizienz wurde durch die zusätzliche Einführung einer stillen, den Protospacer-Adjacent-Motif (PAM) disrumpierenden Mutation neben der Korrektur weiter gesteigert, was wahrscheinlich die erneute Bindung von Cas9 an das editierte Allel verhindert und die durch Mismatch-Reparatur vermittelte Reversion reduziert. Die Editierungsergebnisse wurden mithilfe von CRISPResso2 und EditR quantifiziert. Zusammengenommen begründen diese Ergebnisse eine skalierbare, kosteneffiziente Pipeline zur Modellierung seltener Erkrankungen und allelspezifischen Korrektur, die auf viele UDN-identifizierte Varianten übertragen werden könnte.